7: Choix d’une technique de laboratoire à la recherche d’une aneuploïdie

Chapitre 7 Choix d’une technique de laboratoire à la recherche d’une aneuploïdie



A. Guichet


L’obstétricien dispose de différentes techniques de prélèvement : amniocentèse, choriocentèse, ou prélèvement de sang fœtal. Le généticien dispose également de différents outils qui vont de la cytogénétique classique à la cytogénétique moléculaire en passant par des techniques de génétique moléculaire. C’est de leur concertation, s’appuyant sur une bonne connaissance du contexte clinique, voire échographique, que résulte la meilleure option diagnostique. Celle-ci prend principalement en compte d’une part les risques du prélèvement, et d’autre part la rapidité d’obtention du caryotype, la qualité de l’examen chromosomique ainsi que les possibilités du plateau technique moléculaire à disposition.



Caryotype fœtal



Cytogénétique classique ou conventionnelle


Le caryotype consiste à établir la carte chromosomique d’un individu afin d’explorer le nombre et la structure de ses chromosomes. La formule chromosomique normale d’un homme est 46,XY et celle d’une femme est 46,XX.


Pour être visualisés, les chromosomes doivent être étudiés dans un état de condensation important de la chromatine, plus précisément au stade métaphasique de la mitose cellulaire. Il est donc nécessaire que les cellules étudiées puissent entrer en division, ce qui est plus ou moins aisé à obtenir en fonction du type cellulaire utilisé [1].



Principe des techniques



Obtention de cellules en division


Selon le tissu étudié, il existe trois manières d’obtenir des cellules en division :


• soit il existe une activité mitotique spontanée (trophoblaste) ;

• soit on fait entrer les cellules dans le cycle cellulaire en utilisant des mitogènes (la phytohémagglutinine pour la culture de lymphocytes sanguins) ;

• soit on respecte le cycle cellulaire (les amniocytes d’un liquide amniotique).

La durée du cycle cellulaire propre à chaque type cellulaire explique le délai pour l’obtention des résultats pour un caryotype fœtal. En effet, lorsqu’il existe une activité mitotique spontanée, le résultat peut être donné en quelques heures (tissu trophoblastique) ; lorsqu’il existe un mitogène (qui peut agir sur les lymphocytes T), le résultat peut être donné en quelques jours pour le sang veineux. En revanche, lorsque l’on est tributaire du cycle cellulaire, il faut attendre que les cellules adhèrent et se multiplient (culture par adhésion cellulaire) ; ainsi, un délai d’au moins 7 jours est nécessaire pour l’obtention d’un caryotype à partir d’une ponction de liquide amniotique.



Obtention de métaphases analysables


Les chromosomes sont visibles pendant la métaphase de la mitose. On utilise un poison du fuseau mitotique, la colchicine, qui permet de bloquer toutes les cellules entrées dans le cycle cellulaire au stade métaphasique. Un choc hypotonique permet ensuite de faire gonfler les cellules et de disperser les chromosomes au sein de cette cellule [2]. Les mitoses sont ensuite fixées et, s’il s’agit d’une culture en suspension (comme la culture de lymphocytes sanguins), elles sont étalées sur lames.



Marquage des chromosomes



Banding


Pour identifier les chromosomes obtenus par cette technique, on utilise un système de marquage ou chromosome banding. Il existe deux systèmes de bandes, les bandes G et les bandes R, qui colorent chacune 50 % de l’euchromatine. Ces deux marquages sont réalisés soit systématiquement, soit pour le diagnostic prénatal, on peut n’utiliser qu’un seul banding. Les bandes G, riches en adénine et thymidine, sont obtenues après dénaturation enzymatique par la trypsine et coloration par le Giemsa. Les bandes R correspondent aux régions du génome riches en cytosine et guanine et sont obtenues après dénaturation thermique et coloration par le Giemsa. Les bandes R ont été appelées ainsi pour reverse banding, c’est-à-dire qu’une bande qui est noire en bandes G est blanche en bandes R, et vice versa. Le banding permet donc d’obtenir une alternance de bandes sombres et de bandes claires dont la séquence est spécifique de chaque paire chromosomique et constante chez l’homme. Le banding d’une paire chromosomique correspond à un véritable code-barres permettant d’identifier cette paire chromosomique.



Résolution


Si l’on compte le nombre de bandes obtenues lors d’une technique cytogénétique, en partant du chromosome 1 jusqu’au chromosome 22 et en comptant les chromosomes X et Y, on obtient un certain nombre de bandes par génome haploïde : cela définit la résolution. Un examen cytogénétique standard permet d’obtenir environ 400 bandes par lot haploïde. Cette résolution peut être améliorée en utilisant des artifices techniques et l’on peut obtenir une haute résolution, c’est-à-dire environ 550 ou 800 bandes par génome haploïde (fig. 7.1).


image

Fig. 7.1 Paires de chromosome 15 : exemples de différentes résolutions obtenues entre 400 bandes (prénatals) et plus de 550 bandes (postnatal)


La résolution obtenue est très différente selon le prélèvement considéré. En effet, l’étude directe d’un trophoblaste permet d’obtenir une résolution entre 300 et 400 bandes, la culture de trophoblaste et celle de liquide amniotique permettent d’obtenir une résolution entre 400 et 500 bandes, alors que le sang fœtal permet d’obtenir une résolution autour de 550 bandes, voire plus si l’on utilise des techniques dynamiques. Cette notion de résolution explique pourquoi l’on peut discuter le type de prélèvement prénatal à réaliser suivant que l’on s’oriente plutôt vers une anomalie de structure ou plutôt vers une anomalie numérique.


Le compte rendu d’un résultat de caryotype fœtal doit préciser :


• le type de culture ;

• la technique de marquage chromosomique utilisée selon la codification de la nomenclature internationale ;

• le nombre de cellules examinées, ou le nombre de clones obtenus pour les cultures in situ ;

• la formule chromosomique du patient selon la nomenclature internationale. Une formule chromosomique s’écrit comme suit : nombre total de chromosomes, chromosomes sexuels. Ainsi, une formule chromosomique féminine normale s’écrit : 46,XX.

• si un remaniement chromosomique est observé, il est décrit après cette première écriture en précisant le type d’anomalie, le chromosome concerné et enfin les points de cassure. Par exemple, une translocation réciproque équilibrée (t) entre un chromosome 2 et 8 s’écrit : 46,XX, t(2 ; 8)(p21 ; q31) ;

• un commentaire sous forme d’une courte conclusion.


Choix d’une méthode


Les prélèvements ovulaires seront traités dans un chapitre à part ; seront juste citées dans ce chapitre les particularités cytogénétiques de chaque tissu.



Amniocentèse


La culture de liquide amniotique a pour avantage une interprétation plus facile des résultats devant une mosaïque ou une pseudo-mosaïque grâce aux techniques de culture in situ et la présence de clones. Elle révèle des mosaïques rares (0,3 %) souvent indétectables sur sang fœtal et, enfin, la résolution obtenue est satisfaisante.


En revanche, le délai d’obtention du caryotype est au minimum de 8 à 10 jours.


C’est le prélèvement le plus pratiqué (environ 85 % des diagnostics prénatals en France sont réalisés à partir de liquide amniotique), car il répond à la très grande majorité des indications.



Choriocentèse


L’avantage de cette méthode est qu’à partir d’un prélèvement de trophoblaste, on réalise un examen direct (résultats en 24 à 48 heures) et une culture du trophoblaste (résultats en 15 jours). Pour l’étude directe, il est nécessaire d’obtenir 10 à 20 mg de tissu ; pour la culture de trophoblaste, 10 mg peuvent suffire.


En revanche, il arrive que la formule chromosomique retrouvée à partir du trophoblaste soit différente de celle observée chez le fœtus. Il s’agit d’une discordance fœtoplacentaire qui se rencontre dans 1 à 2 % des examens réalisés. Ces mosaïques confinées au placenta peuvent avoir un retentissement important sur la croissance fœtale et être responsables de retard de croissance intra-utérin (exemple : chromosome 16). Par conséquent, il est maintenant admis de réaliser systématiquement un examen direct et une culture pour chaque prélèvement de trophoblaste. De plus, la résolution obtenue par l’examen direct est souvent inférieure à celle obtenue sur le liquide amniotique ou le sang fœtal.


Pour notre équipe, la choriocentèse ne constitue pas une indication lorsque l’on recherche une anomalie fine de la structure chromosomique. Elle est réservée à la recherche d’une anomalie numérique.



Prélèvement de sang fœtal


L’avantage de cette méthode est de pouvoir réaliser un caryotype fœtal à partir de 0,5 ml de sang fœtal en sachant que la quantité optimale, pour notre laboratoire, se situe aux alentours de 1 ml. C’est l’examen cytogénétique fœtal qui permet d’avoir la meilleure résolution chromosomique. Il est donc particulièrement indiqué devant un ou plusieurs signes d’appel échographiques, car dans ces cas on recherche autant une anomalie de structure qu’une anomalie numérique. De plus, le résultat du caryotype peut être connu dans un délai très court, de l’ordre de 2 à 3 jours. Cependant, avec les techniques d’hybridation in situ, de moins en moins de prélèvements de sang fœtal sont réalisés uniquement pour la seule indication de caryotype fœtal.



Cytogénétique moléculaire ou techniques d’hybridation in situ



Principe


L’hybridation in situ (HIS, ou FISH en anglais) consiste à hybrider des sondes sur des préparations cytologiques, « in situ », en l’occurrence sur des préparations de chromosomes métaphasiques [3]. L’intérêt de cette méthode d’hybridation est qu’elle repose sur l’utilisation de sondes froides, non radioactives ; de plus, elle permet de respecter la morphologie des préparations étudiées.


Les sondes sont marquées avec des fluorochromes, ce qui permet, selon le fluorochrome utilisé, d’observer au microscope à fluorescence des signaux verts (FITC) ou rouges (Cy3, rhodamine, texas-red). Les sondes utilisées peuvent être commercialisées ou bien synthétisées par chaque équipe. Les sondes commercialisées concernent :


• la peinture chromosomique ou chromosome painting : il s’agit d’un ensemble de sondes spécifiques d’un chromosome entier qui permet d’obtenir un signal fluorescent de l’ensemble de ce chromosome, c’est-à-dire de l’extrémité du bras court à celle du bras long du chromosome ;

• des sondes centromériques ou télomériques spécifiques de chaque chromosome ;

• des sondes spécifiques d’une partie du génome correspondant principalement à des syndromes microdélétionnels. Il s’agit de délétions qui ne sont pas visibles sur un caryotype standard, ou à la limite de la visibilité en technique haute résolution, mais dont le diagnostic devient possible en utilisant les techniques d’HIS. C’est ainsi, par exemple, que l’on réalise le diagnostic du syndrome de Prader-Willi en utilisant la sonde 15q11, celui du syndrome de Wolff-Hirschhorn en utilisant la sonde 4p16, et celui du syndrome de DiGeorge en utilisant la sonde 22q11.

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Jul 8, 2017 | Posted by in MÉDECINE INTERNE | Comments Off on 7: Choix d’une technique de laboratoire à la recherche d’une aneuploïdie

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