Exemples de solvants	Types de solvants	Caractéristiques
Acide formique Acides carboxyliques	Protiques et polaires	Formation de liaisons hydrogène (++) Pouvoir ionisant (++) Moment dipolaire (++)
Acétonitrile Acétone Diméthylsulfoxide	Aprotiques et dipolaires	Pas de liaisons hydrogène Pouvoir ionisant (++) Miscibles à l’eau
Hexane Benzène Toluène Tétrachlorure de carbone	Aprotiques et apolaires	Pas de liaisons hydrogène Moment dipolaire faible Non miscibles à l’eau Utilisation en ELL (+++)
Éther Tétrahydrofurane	Aprotiques et peu polaires (solvants intermédiaires)	Pas de liaisons hydrogène Moment dipolaire faible Utilisation en ELL (+++)

Facteurs influençant l’extraction

Matrice

Une extraction idéale d’une matrice biologique complexe doit permettre d’extraire uniquement le soluté et de laisser tous les autres constituants d’origine exogène ou endogène dans la matrice. En pratique, le solvant doit être le plus sélectif possible vis-à-vis du soluté.

Soluté

Ses caractéristiques physicochimiques et en particulier sa structure chimique influencent le coefficient de partage ; plus important pour les molécules à longues chaînes carbonées et pour un nombre de carbones identique, plus important pour les molécules à chaînes ramifiées. La présence d’hétéroatomes comme les oxygènes ou les azotes diminue ce coefficient alors que la présence d’un halogène favorise le passage dans la phase organique.

pH

Seules les molécules neutres sont extractibles par les solvants organiques. Ainsi, pour extraire un anion A–, on diminuera le pH pour favoriser l’apparition de la forme moléculaire AH et pour un cation BH⁺, on augmentera le pH pour augmenter la forme extractible B.

On comprend l’intérêt de connaître la constante d’acidité des molécules (pKa) pour pouvoir se situer dans une zone de pH à pKa −2 pour les molécules acides et pKa +2 pour les molécules basiques. Ainsi, dans ces conditions, la forme moléculaire sera majoritaire à 99 %. S’il n’est pas possible de rendre la molécule neutre, on choisira une autre alternative, la formation de paires d’ions.

Principales méthodes d’extraction liquide-liquide

Nombreuses et variées sont les méthodes d’ELL décrites dans la littérature. Elles permettent la concentration et la purification à partir de matrices biologiques de très nombreuses molécules comme les médicaments, les stupéfiants, les pesticides, les stéroïdes, les métaux… parfois de façon simultanée.

Extraction simple : en une seule étape

Après mise en contact de la matrice biologique et du solvant d’extraction, une agitation pas trop brutale est réalisée pour éviter les phénomènes d’émulsions nuisibles à la reproductibilité de l’extraction. Puis après décantation, pouvant être accélérée par une centrifugation, la phase organique est isolée puis évaporée pour une concentration des analytes d’intérêt. Cette technique n’est pas spécifique d’une molécule car le solvant employé peut extraire de la matrice toutes les molécules ayant des propriétés physicochimiques proches. Cette caractéristique peut être cependant mise à profit afin d’extraire en une seule étape un groupe de molécules, par exemple de la même famille comme les benzodiazépines [3]. On peut également extraire en une seule étape en utilisant des mélanges de solvants [2]. Ceux les plus fréquemment utilisés sont chloroforme/heptane/propanol-2 [4], toluène/acétate d’éthyle [4] ou hexane/diéthyléther [5].

Extraction multiple

Utilisée lorsque le rendement d’extraction simple n’est pas satisfaisant. On parle alors d’extraction par épuisement. Les différents extraits obtenus sont par la suite mélangés puis concentrés pour isoler le soluté. Cependant, cette méthode reste consommatrice de gros volumes de solvants et augmente le temps de traitement de l’échantillon. L’extraction multiple est également utilisée lorsque l’extrait n’est pas suffisamment purifié et le soluté est en général resolubilisé dans une phase aqueuse, qui peut servir directement de solvant d’injection en chromatographie. On parle d’« extraction en retour » (back extraction). Les antidépresseurs sérotoninergiques peuvent être ainsi extraits du plasma par un mélange hexane/alcool isoamylique, puis par une phase aqueuse acide avant analyse en CLHP-DAD [6].

Extraction par paires d’ions

Par élimination ou camouflage de la charge d’un ion par une molécule de charge opposée ou « contre-ion », pouvant être ainsi plus facilement extrait par un solvant organique. Les paires d’ions peuvent être formées par des composés tensioactifs anioniques comme le dioctylsulfosuccinate de sodium ou des ammoniums quaternaires à longues chaînes.

ELL sur support solide

Les supports sont des terres de diatomées développées par les industriels : ChemElut^®, Tox Elut^® (Varian), Clean Elutr (Merck), Extrelut NT^® (Interchim). Ils sont conditionnés dans des cartouches type EPS. Dans un premier temps, on dépose directement la matrice sur la cartouche pour une adsorption de la phase aqueuse de la matrice, puis on dépose le solvant d’extraction dans un second temps. Il se crée alors un équilibre entre la phase aqueuse adsorbée et la phase organique avec passage de l’analyte d’intérêt dans la phase organique, récupérée dans un second temps. Les applications sont identiques à celles décrites par les techniques classiques d’ELL. On citera comme exemple, la recherche des antidépresseurs [7, 8] ou des benzodiazépines [9] dans le sang total.

Avantages et inconvénients

L’ELL est une technique permettant la concentration des échantillons et la purification, ce qui peut dans certains cas solubiliser les solutés d’intérêt, éliminer les molécules interférentes et permettre par exemple de limiter les effets de matrice avec suppression ou amplification d’ions en CLHP/SM-SM en mode électrospray. Cette méthode présente également l’avantage de pouvoir travailler sur des matrices plus difficiles comme le sang laqué post mortem, les viscères ou les cheveux qui ne sont pas toujours compatibles avec l’EPS. Elle présente cependant les inconvénients d’être longue et difficilement automatisable, consommatrice de solvants organiques souvent toxiques, et n’est pas la méthode de choix pour les molécules très polaires qui préféreront les méthodes de précipitation ou d’EPS.

Extraction en phase solide

L’extraction en phase solide, ou EPS [10], est une bonne alternative à l’ELL, notamment quand les échantillons sont très chargés en protéines et quand l’automatisation est nécessaire. Elle est appliquée avec succès aux échantillons post mortem type liquides biologiques ou tissus, avec des dilutions appropriées.

L’EPS est basée sur le partage de composés entre une phase liquide, l’échantillon type sang, plasma ou urine et une phase stationnaire solide, l’absorbant. Depuis les années soixante-dix, la gamme de phases stationnaires a considérablement augmenté. À côté des premières phases en silice, on a largement investi dans l’ensemble des types de phases stationnaires actuellement utilisées comme phases séparatives en CLHP.

L’extraction de molécules d’une phase aqueuse impose l’utilisation de phases pour lesquelles l’eau est peu éluante : silices greffées par des chaînes hydrocarbonées de type C8 ou C18 par exemple. L’apparition de supports polymériques, d’une étendue de phases de volumes variables, de plaques 96 puits destinées à de grandes séries ont ensuite permis d’élargir la gamme de l’extraction en phase solide. Les conditionnements les plus adaptés à une utilisation en toxicologie sont les cartouches de volume compris entre 1 et 5 mL avec une quantité de phase variable de 30 à 500 mg. L’application des fluides se fera le plus couramment par pression négative utilisant un système de pompe à vide.

On rencontre également des phases stationnaires mixtes, dont le principe est basé sur des interactions hydrophobes et des échanges ioniques permettant d’être plus sélectif dans la préparation d’échantillon.