TP 5. Conditions d’activité d’une enzyme
OBJECTIF
◗ Connaître le rôle du pH sur l’activité des enzymes.
Quelle est l’influence du pH sur l’activité d’une enzyme digestive, la lactase ?
I. Principe
La lactase est une enzyme du suc pancréatique qui hydrolyse le lactose. Elle coupe la liaison osidique liant le galactose et le glucose. Il existe une molécule synthétique, l’orthonitrophényl β-D galactoside (oNPG), qui est également hydrolysée par cette enzyme (cf.Document 1).
Ce substrat va être utilisé pour étudier l’activité de la lactase en fonction du pH, car son hydrolyse libère le galactose et l’orthonitrophénol, qui est jaune. On pourra suivre la formation de l’orthonitrophénol grâce à l’intensité de coloration (absorbance) mesurée au spectrophotomètre (415 à 420nm).
On met en contact la lactase et l’oNPG pendant exactement 5min et on arrête la réaction enzymatique grâce à une solution de Na2CO3 qui inactive l’enzyme.
II. Étude de l’activité enzymatique de la lactase de pH 2 à pH 9
Matériel
Spectrophotomètre, tubes à essai, lactase à 500 U.mL−1, oNPG à 5mmol.L−1, solutions tampon à différents pH, solution d’arrêt Na2CO3 à 1mol.L−1, bain-marie à 37°C, pipettes de 2mL, poire d’aspiration, micropipette de 500μl.
Mode opératoire
Marquer au feutre huit tubes, de pH 2 à pH 9, puis huit autres tubes « blanc », également de pH 2 à pH 9.
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