• une micropipette (ou pipette micrométrique) est appliquée sur une membrane cellulaire contenant le canal ionique à étudier (fig. 4.1A) ;

• le morceau de membrane est détaché pour former le « patch » : la pipette est fermée à cette extrémité, les ions ne pourront passer à travers la membrane qu’au niveau des canaux qui sont spécifiques d’un type d’ions (fig. 4.1B) ;

• le patch est monté sous forme de micro-électrode dans un bain où se situe l’autre électrode (fig. 4.1C) : si le bain est équilibré en ions, lorsque l’on va délivrer une ddp entre les deux électrodes (par un générateur électrique), on aura une valeur fixe mesurée sur un oscilloscope (c’est le « clamp »). Lorsqu’on ajoute dans le bain un composé qui active spécifiquement le canal ionique, on crée le passage d’ions qui viennent modifier cette valeur de base ; c’est une mesure de potentiel de membrane. On peut varier les agonistes (activateurs), la nature et la concentration des ions, ajouter des antagonistes (inhibiteurs) et bien sûr le type de membranes avec d’autres patchs.

• Ion calcium : cet ion est un important régulateur des fonctions cellulaires ; on peut le doser dans la cellule par complexation ; par exemple dans la méthode au fura-2, sa complexation au Ca²⁺ va créer une fluorescence rouge dont l’intensité est proportionnelle à la concentration en Ca²⁺. L’observation se fait au MO en fluorescence.

• Ion H⁺ : c’est une mesure du pH intracellulaire (pH = −log[H⁺]) ; il existe des fluorochromes spécifiques de H⁺.

• Emploi d’émetteurs β : ³H-thymidine pour étudier l’ADN (réplication, mitose…) ; ³H− ou ¹⁴C−Leu pour étudier les protéines ; ³²P pour étudier les phosphorylations (AcN et protéines).

• Emploi d’émetteurs γ : ³⁵S−Met pour étudier les protéines.

• Déroulement du pulse : préparation de la dilution isotopique (précurseur radiomarqué/précurseur « froid »), application dans le modèle de culture cellulaire, et révélation par autoradiographie ou comptage de la radioactivité (compteur type Geiger, compteur β ou γ).

• Critère de pureté : lecture par un système optique intégré à l’ultracentrifugeuse ; le pic optique est fin et symétrique (loi de Gauss) si la macromolécule est pure (fig. 4.4).

• Mesure de masse moléculaire : Mr en kDa (mesure indirecte car macromolécule à plusieurs concentrations, et en mesurant le coefficient de diffusion ou le rayon de Stockes, R_S).

• Mesure de taille et de forme : S⁰_ω,20 (S extrapolé à concentration nulle, dans l’eau et à 20 °C).

• centrifugation zonale (ou en gradient de vitesse) : la séparation des macromolécules se fait en fonction de la taille (R_S) donc de leur vitesse de sédimentation dans le gradient de densité ; les macromolécules présentant un coefficient S plus élevé sédimentent plus vite. Principe surtout utilisé pour les protéines et les cellules, en gradient de saccharose (sucrose) ou en gradient synthétique (fig. 4.5A). Voir chapitre 2, p. 21 à 23;

• centrifugation à l’équilibre ou « isopycnique » (ou en gradient d’équilibre) : la séparation des macromolécules se fait en fonction de la densité, généralement en gradient de densité autoformé. Les macromolécules sédimentent vers la zone du gradient correspondant à leur densité propre ; elles semblent « flotter » chacune dans une zone du gradient. On peut par exemple séparer des lipoprotéines sur gradient de LiCl (densité de flottation des lipoprotéines), ou des AcN sur gradient de CsCl₂ (densité de compaction de l’ADN) (fig. 4.5B).