31 Cellules souches embryonnaires humaines
Les premières lignées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEH) ont été dérivées à partir de la masse cellulaire interne de blastocystes humains en 1998. Grâce à leurs propriétés d’autorenouvellement et de différenciation cellulaire potentielle dans tous les types de cellules du corps humain, ces CSEH ont révolutionné la recherche biomédicale ces dernières années. La technologie des CSEH a ouvert de nouvelles perspectives dans la recherche fondamentale et dans les applications thérapeutiques en médecine. Les CSEH offrent ainsi la possibilité de générer des modèles cellulaires humains des maladies humaines et de développer la médecine régénératrice. La recherche sur les CSEH a aussi permis de développer la reprogrammation cellulaire de cellules différenciées à l’état de pluripotence et générer ainsi des cellules pluripotentes induites (CPI).
I Pluripotence
La pluripotence correspond au fait qu’une cellule souche a la capacité de se différencier dans n’importe lequel des trois feuillets embryonnaires : entoblaste, mésoblaste et ectoblaste. Les cellules souches pluripotentes peuvent ainsi donner naissance à tous les types cellulaires fœtaux ou adultes. In vivo, l’état de pluripotence des cellules de la masse cellulaire interne (MCI) est transitoire au cours du programme du développement embryonnaire. Ces cellules de la masse cellulaire interne peuvent être isolées et maintenues in vitro dans un état indifférencié et correspondre à ce que l’on appelle les cellules souches embryonnaires. Les cellules souches embryonnaires ont été dérivées la première fois en 1981 à partir de cellules de la MCI chez la souris. En 1998, les cellules souches embryonnaires humaines ont été dérivées à partir d’embryons surnuméraires obtenus par fécondation in vitro. Les cellules souches embryonnaires expriment des marqueurs spécifiques tels que des antigènes embryonnaires spécifiques, des activités enzymatiques (phosphatase alcaline, télomérase) et des gènes de pluripotence tels que OCT4 et Nanog qui sont réprimés au cours de la différenciation. Sous certaines conditions de culture cellulaire, les cellules souches embryonnaires peuvent se diviser de façon indéfinie dans un état indifférencié. Ces cellules souches embryonnaires gardent la capacité comme les cellules de la masse cellulaire interne de se différencier en n’importe quel type cellulaire. In vivo, ces cellules souches embryonnaires se différencient en tératomes qui correspondent à des tumeurs comportant des cellules différenciées provenant des trois feuillets embryonnaires : entoblaste, mésoblaste et ectoblaste. Les cellules souches embryonnaires humaines représentent donc une source illimitée de cellules ou de tissus pour la thérapie cellulaire.
II Cellules souches embryonnaires humaines
A Dérivation des lignées CSEH
Il existe différentes sources de cellules souches humaines qui varient en fonction de leur potentiel de développement (fig. 31.1). Les cellules embryonnaires avant le stade blastocyste sont dites totipotentes car elles ont la capacité de former tous les tissus embryonnaires ainsi que les annexes embryonnaires. Les cellules souches adultes multipotentes peuvent être dérivées de la moelle osseuse ou d’autres organes. Les cellules souches fœtales multipotentes peuvent être obtenues à partir du sang de cordon ombilical ou de tissus fœtaux humains. Les cellules souches embryonnaires humaines pluripotentes proviennent d’embryons humains surnuméraires, au stade blastocyste, issus de fécondation in vitro réalisée pour la prise en charge des couples infertiles, ou d’embryons atteints d’une maladie génétique détectée par le diagnostic génétique préimplantatoire. Les embryons surnuméraires aptes à se développer sont le plus souvent cryoconservés dans le cadre d’un projet parental. En l’absence de projet parental et avec l’accord du couple, les embryons surnuméraires peuvent être donnés à un autre couple dans le cadre de l’accueil d’embryon, ou être détruits, ou être donnés à la recherche dans le cadre de la loi de bioéthique.
Pour établir une lignée de CSEH, il faut isoler les cellules de la MCI d’un blastocyste. La zone pellucide est éliminée par digestion enzymatique ou par microdissection laser. Le blastocyste sans la zone pellucide est ensuite traité pour éliminer les cellules trophoblastiques par immunochirurgie avec des anticorps anticellules trophoblastiques. Cette méthode permet la lyse des cellules trophoblastiques par une réaction anticorps–complément. La MCI ainsi isolée est placée dans une boîte de culture cellulaire sur une couche nourricière composée de cellules fibroblastiques de souris dont l’activité mitotique a été inactivée. Les cellules de la MCI qui se divise sont ensuite transférées par dissociation cellulaire mécanique dans de nouvelles boîtes de culture environ tous les 7 jours. L’observation microscopique permet d’analyser la morphologie des CSEH. Le milieu de culture utilisé pour la culture cellulaire des CSEH est complété avec un facteur de croissance des fibroblastes (bFGF) et une cytokine permettant le maintien des CSEH en état d’autorenouvellement. Les lignées de CSEH peuvent être maintenues en culture indéfiniment en gardant le potentiel de différenciation dans tous les types cellulaires humains (fig. 31.2). La dérivation et la mise à disposition des lignées de CSEH sont encadrées par des règles éthiques et légales dans la plupart des pays. En France, la recherche sur l’embryon est encadrée par la loi de bioéthique et les autorisations de dérivation de CSEH et d’utilisation des CSEH en recherche sont données par l’Agence de la biomédecine et publiées au Journal officiel.
B Culture des lignées de CSEH
Le maintien en culture et la multiplication des CSEH sont des étapes nécessaires dans l’étude des CSEH et de leurs applications pour permettre de fournir le matériel cellulaire suffisant pour toutes les étapes suivantes de différenciation cellulaire à visée thérapeutique ou de recherche (fig. 31.3). Pour permettre le maintien indifférencié et l’amplification des CSEH, les colonies cellulaires sont généralement cocultivées avec des fibroblastes murins (fig. 31.4). Les fibroblastes murins fournissent dans le milieu de culture des facteurs de croissance qui permettent la croissance indifférenciée des CSEH.
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