2 Techniques de fractionnement tissulaire et cellulaire et de culture cellulaire
I Modèles d’étude
A Organismes unicellulaires
1 Modèle de procaryote
Escherichia coli (colibacille : bactérie en bâtonnets Gram négatif), modèle utilisé dans les études fondamentales sur la réplication, la transcription, la traduction (biologie moléculaire des procaryotes : génome séquencé), la division cellulaire, la structure des flagelles (biologie cellulaire), les antigènes de surface (immunologie), la respiration aérobie (biochimie métabolique) ; cette bactérie permet aussi la production industrielle d’enzymes (EcoR1) et de protéines recombinantes…
2 Modèles d’eucaryotes unicellulaires
• Levures : Saccharomyces cerevisiae (levure de bière ou de boulanger, bourgeonnement), modèle utilisé dans les études fondamentales sur la biologie moléculaire des eucaryotes (génome séquencé), la fermentation (respirations aérobie et anaérobie), la reproduction asexuée ; cette levure sert beaucoup aux productions industrielles (pains, bières, vins, yaourts…), donc à l’alimentation humaine.
• Protozoaires : Paramecium sp. (Paramécie : protozoaire cilié, sexué, « bouche » primitive), modèle utilisé en biologie fondamentale (reproductions sexuée et asexuée, exception au code génétique, échanges par diffusion, phagocytose, cils vibratiles…).
B Organismes pluricellulaires (métazoaires)
• Végétaux : Arabidopsis thaliana (arabette des dames), plante modèle en biologie végétale (génome séquencé).
• Mollusques : Caenorhabditis elegans (ver Nématode), animal modèle qui permet l’étude du développement embryonnaire (différenciation), du vieillissement et de l’apoptose (eutélie : ver adulte mâle à nombre fixe de cellules : 1031 à partir de 1090, gènes Ced), et des études sur le système nerveux.
• Insectes : Drosophila melanogaster (mouche du vinaigre, insecte diptère avec un dimorphisme sexuel), organisme modèle de la génétique (génome séquencé, quatre chromosomes dont un sexuel, sans recombinaisons ni transformations génétiques…) : déterminisme du sexe, développement et embryogenèse, génétique du comportement, neurosciences (vision).
• Vertébrés : Danio rerio (poisson-zèbre ou zebrafish), production d’OGM (protéines fluorescentes), autorégénération…
• Xenopus laevis (xénope du cap, Amphibien ressemblant à un Batracien aquatique primitif), animal modèle qui permet l’étude du développement embryonnaire (maturation de l’ovocyte), du cycle cellulaire (mitose et méiose), de la réparation de l’ADN…
• Primates : Macaca mulatta (singe Rhésus ou macaque), découverte du système sanguin Rhésus, modèle d’étude sur le comportement et en pharmacologie.
II Isolement et culture des cellules
A Méthodes séparatives
1 Méthodes de dissociation des tissus
a Méthodes mécaniques
La dissociation ou la dissection du tissu peut se faire à l’aide d’un scalpel (outil proche du bistouri chirurgical), lame métallique coupante portée par un manche, métallique ou en plastique ; la lame est fixe ou amovible. En biologie cellulaire, on utilise surtout des scalpels à manche en plastique (matériel stérile à usage unique).
Pour un travail plus fin et plus précis (microdissection), on peut travailler sous loupe binoculaire ou microscope à l’aide d’outils miniaturisés (scalpels, pinces, aiguilles…). On utilise maintenant la microdissection par un laser couplé à un microscope optique (microdissection-laser). Cette méthode, très onéreuse, permet d’isoler des cellules une par une ; ce travail peut s’avérer long et fastidieux, mais efficace et irremplaçable.
b Méthodes enzymatiques
La dissociation des tissus peut être efficacement effectuée par l’emploi d’enzymes qui hydrolysent la matrice extracellulaire (MEC) ; les cellules vont se décoller et passer en suspension. On utilise la collagénase hydrolysant spécifiquement le collagène, la hyaluronidase hydrolysant l’acide hyaluronique et les protéoglycanes, toutes des macromolécules constitutives de la MEC. La trypsine (protéase peu spécifique) est plutôt utilisée pour le repiquage des cultures.
2 Méthodes de séparation des différents types cellulaires
a Centrifugation
Son principe sera vu plus loin. Dans cet emploi préparatif, on utilise surtout la centrifugation sur gradient de densité. Ce gradient peut être naturel (saccharose ou « sucrose »), ou synthétique, mais hydrophile, neutre et stérilisable (produits commerciaux brevetés : Percoll®, particules recouvertes de polyvinylpyrrolidone ; Ficoll®, polysaccharide hautement branché ; Nicodenz®, dérivé du métrizamide). Ils permettent la séparation de cellules, d’organites subcellulaires, de virus et de macromolécules (séparation par la densité).
b Filtration sur tamis
Voici un exemple de protocole de séparation de différents types cellulaires à partir d’un tissu combinant plusieurs de ces méthodes (fig. 2.1). On désire séparer les quatre principaux types cellulaires du foie de rat (un modèle animal de la physiopathologie humaine), afin de les mettre en culture pour étudier leurs rôles respectifs dans des maladies hépatiques (modèle du foie isolé-perfusé). Le rat est sacrifié, le foie isolé, puis perfusé par la veine porte :
• soit (perfusion 1) d’une solution de collagénase à 37 °C pour séparer le type cellulaire majoritaire, les hépatocytes (ou cellules parenchymateuses du foie) ;
• soit (perfusion 2) de cette solution additionnée de diverses protéinases dans le but d’isoler les cellules étoilées du foie (ou cellules de Ito).
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